敖德萨市民也被动员起来，加入城市保卫战中，其中还包括一个约900人的妇女防御营。
至此，苏军在敖德萨的防御兵力扩大至3.5万人，还拥有火炮和迫击炮2000余门，坦克400余辆和300余架作战飞机。
1941年7月下旬，罗马尼亚军队夺回了一年前失去的比萨拉比亚，并完成进攻敖德萨的准备。
担任主攻的是罗马尼亚第4集团军，德军第11集团军一部负责在罗军左翼实施辅助进攻。
8月5日，罗军第4集团军以5个步兵师、2个骑兵师又1个摩托化旅，从格里戈里奥波尔地域向敖德萨远接近地发起进攻。
8月8日，罗军攻占亚历山德洛夫卡镇，打开了远接近地的一个缺口，随后苏军部队发起了反击，试图夺回该镇，双方的战斗从上午一直打到黄昏，随着罗马尼亚第1装甲师第1装甲团师投入战斗，苏军被迫撤退。
至8月10日，罗军兵力增至12个师又7个旅，兵力是苏军的5倍，并向苏军发起全线进攻。
苏军滨海集团军且战且退，从敖德萨远接近地撤至前进防御地区。
8月13日，罗军在季利古尔湖以东进抵黑海之滨，切断了敖德萨守军与外界的陆上联系，敖德萨成为深陷轴心国军队后方的一座孤城，形势更加危急。
此后的几天里，罗马尼亚军队在装甲部队的协助下，对苏军外围防御阵地实施了迂回切割攻击，迫使苏军收缩防线。
8月15日，罗军转入重点进攻，集中兵力从东北和西北两翼向敖德萨突击。
在西北方向，罗军以3个步兵师和第1装甲师沿着拉兹杰利纳亚至敖德萨铁路线展开坚决突击，逐渐推进至敖德萨主要防御地带、抵近市区。
双方争夺的重点转为位于城市西郊的供水泵站，罗军认为，一旦夺取这里，城内供水将被切断，苏军必然无法固守城市。
罗军的进攻首先在供水泵站不远的米哈伊洛夫卡镇发起。
进攻刚开始不久，同样清楚这里重要性的苏军第95师就组织反击。
在这一天的战斗中，罗军参战部队战斗减员达50%，几天前在亚历山德罗洛卡击退苏军的第1装甲师第1装甲团在战斗中几乎损失了全部坦克，装甲团团长也在战斗中阵亡。
此战，苏军第95师第163团荣立集体功，该团第3营营长布列乌斯中尉获得苏联英雄称号。
但由于苏军的兵力有限，罗军在损失惨重的情况下还是顶住了苏军的反击，并夺取了米哈伊洛夫卡镇和供水泵站，切断了敖德萨的淡水供应。
此后，苏军黑海舰队不得不减少武器弹药的运输，向城内供应淡水。
8月19日，为统一指挥该地的陆海军部队，更有效地组织城市防御，敖德萨守军统归黑海舰队指挥。黑海舰队组建以敖德萨海军基地司令茹科夫为司令员的敖德萨防御地域（索夫罗诺夫任副司令员），下设南、西、东3个分区，辖4个师和若干独立部队，共3.45万人。
其中，南线以步兵第25师的2个团防御；西线由步兵第95师防御；东北方向由步兵第421师防御。
8月20日，罗军以17个师又7个旅的兵力向敖德萨市区发起新的进攻。
苏军兵力虽然远低于罗军，但依托敖德萨港口，能够源源不断地接收到从塞瓦斯托波尔输送的装备物资和兵员，并将伤员和一部分工厂撤往后方，所以苏军始终能够守住防线，粉碎罗军的进攻。
8月底，安东内斯库决定不再一味地强攻，转而将重点放在对港口和城区实施持续的炮火和空中突袭，试图阻止黑海舰队进入港口为城市提供补给，摧毁守军的抵抗意志。
此后，苏军的补给几乎中断，黑海舰队只能在夜间依靠小型船运输少量物资入港。
战争开始前，敖德萨市内并没有军工企业。战争爆发后，敖德萨有20多家企业开始生产军用物资，在敖德萨防御战役期间，市民冒着罗军的空袭和炮击，在城内缺少粮食和淡水的情况下，工厂始终全力生产，为城内守军提供了3辆装甲列车、200门82毫米迫击炮和1000余门50毫米迫击炮、1022个战壕投掷火箭、21万枚手榴弹、3万枚反坦克和反步兵地雷，以及大量的燃烧瓶、野战电话、电缆等。
在1个多月的作战中，苏军的损失同样巨大，战前储备的火炮剩下300多门，尚能满足作战需要，坦克则只剩下2辆。
为此，敖德萨的工人们利用拖拉机底盘和工厂撤离时留下的钢材制造了临时坦克（“威慑者1号”）。这些坦克大多装备了7.62毫米机枪，个别坦克装备了37毫米和45毫米火炮。
工人们还发挥主观能动性，为坦克制造了“复合装甲”，这种坦克的装甲钢板有两层，中间用胶合板和橡胶填充，使得坦克具有良好的防御能力，罗马尼亚使用的小口径反坦克炮无法击穿它们的正面。
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